COMPUESTOS FLUORESCENTES: LUZ MOLECULAR
Por Susana Gallardo, CyT - FCEyN,
UBA
Uno de los grandes objetivos de la biología celular es poder explicar, a
nivel de moléculas, todos los procesos que se llevan a cabo en un organismo. Un
sueño sería poder "ver" y seguir en imágenes cómo interactúan determinados
compuestos biológicos y cómo se transmiten las señales que inician procesos
complejos, por
ejemplo, la respuesta inmune o el aprendizaje y la memoria.
Pero la química, mediante el desarrollo de compuestos específicos que pueden
encenderse y apagarse cuando uno lo desea, puede ayudar a "ver" en el
microscopio algunos procesos que antes era imposible visualizar. Una técnica en
particular, denominada "transferencia de energía" (TE), permite decir si dos
biomoléculas están en interacción, esto es, si se acercan dentro de cierto rango
de distancias, o si una o un grupo de ellas se está disociando.
"En el laboratorio fabricamos moléculas que tienen una característica
particular: pueden emplearse como un interruptor. Esto significa que al hacer
incidir luz sobre la molécula, se la transforma y se "enciende" un proceso que
nos interesa. Y, mediante luz, se la puede hacer volver al estado inicial",
explica la doctora Elizabeth Jares, profesora en el Departamento de Química
Orgánica de la Facultad de Ciencias Exactas y Naturales de la UBA. "En
particular, "encendemos" y "apagamos" el proceso
de transferencia de
energía. Esto nos permite medir esa transferencia todas las veces que queramos
sin destruir la muestra, o sea que podemos hacer el seguimiento de un sistema
que cambia en el tiempo, como lo es una célula viva".
Para programar el interruptor molecular, la investigadora aprovecha las
propiedades de unos compuestos muy interesantes denominados fotocrómicos. El
empleo de estos compuestos, que se transforman por la acción de la luz, no es
ninguna novedad. Los anteojos de sol que se oscurecen por la acción de los rayos
ultravioleta son un ejemplo. Otras sustancias cambian de color debido a una
diferencia de temperatura, lo que ha sido ampliamente utilizado en juguetes.
Pero lo novedoso es emplear el cambio que se induce con luz para obtener un
interruptor de la transferencia de energía.
Microscopios más poderosos
El desarrollo de microscopios cada vez más poderosos ha permitido ver lo que
sucede en el interior de la célula. Hoy en día la microscopía de fluorescencia
in vivo permite visualizar en qué región de una célula se encuentra determinado
compuesto biológico. En tal sentido, un avance significativo ha sido la
posibilidad de introducir marcas fluorescentes que se "expresen" o sean
producidas por la célula junto con una proteína de interés. Esto significa que,
por ingeniería genética, se puede lograr que una célula fabrique una molécula
compuesta por una proteína de interés unida a una proteína fluorescente.
Pero, ¿cuál es la aplicación de los interruptores moleculares?
"Para
saber si una molécula interactúa con otra, es necesario ver si en ella se
produce algún cambio, y medir ese cambio. Si al compuesto que quiero investigar
le agrego una molécula interruptora, puedo encenderla y apagarla cuando quiero
y, de este modo, medir los cambios que se producen en ella cuando interactúa con
otra, es decir, está encendida, y cuando no hay interacción, o está apagada",
explica Jares.
Cuando una molécula entra en contacto con otra, le traspasa energía. Midiendo
la emisión fluorescente que tiene la molécula sola, y comparando con la cantidad
que posee al entregar energía a otra, se sabe si hay, o no, interacción. El
problema es lograr que la molécula se encuentre en los dos estados. Para ello es
necesario disponer de dos muestras diferentes o, como en el método utilizado
generalmente, medir las propiedades de la molécula y luego destruirla. Pero la
técnica de la
molécula interruptora permite hacer todo en la misma muestra,
cuantas veces sea necesario, sin destruir la molécula. Sólo se la enciende y
apaga cuando uno lo desea.
Estos procesos no podían visualizarse con un microscopio óptico debido a que
la longitud de onda de la luz sobrepasa en mucho el tamaño de las moléculas. La
mayor parte de los instrumentos de microscopía óptica tiene una resolución de
alrededor de 3 décimas de micrón. Y la técnica TE permite medir distancias entre
compuestos en el rango de milésimas a centésimas de micrón. Es lo más cercano a
"ver" en el microscopio, no sólo si una molécula está en un lugar dado, sino si
se halla involucrada o no en un proceso de interés.
Hasta ahora, sin embargo, la necesidad de "fijar" las muestras -someterlas a
cierta transformación química- ha impedido que el proceso pueda deteminarse in
vivo. Esto es porque se requiere comparar dos estados, lo que implica la
destrucción de una región de la muestra. Pero la técnica desarrollada por la
doctora Jares, que aprovecha la posibilidad de que un compuesto pueda encenderse
y apagarse cuando se desea, permite "ver" los procesos en pleno desarrollo, sin
destruir la muestra.
Al medir las dos situaciones de la molécula, y calcular cuánta energía pasó,
es como si el proceso pudiera "verse". Para Jares, "es como si, de una manera
indirecta, se estuviera aumentando la resolución".
Esta técnica podría ayudar a comprender muchos de los procesos que se llevan
a cabo en la célula, donde están involucradas un gran número de proteínas.
Asimismo, tendría aplicaciones en los métodos de diagnóstico.
Actualmente, en el diagnóstico por imágenes, por ejemplo los métodos de
radioinmunoensayo, las sustancias fluorescentes han reemplazado los compuestos
radiactivos debido a que los primeros son mucho menos nocivos para las personas
que los manipulan y, por ello, requieren menores recaudos. Pero los
fluorescentes son menos sensibles que los radiactivos. Por tal razón, es muy
importante desarrollar métodos más sensibles para detectar fluorescencia.
En tal sentido, el acoplado de una molécula interruptora al compuesto
fluorescente puede contribuir a detectarlo. "Al encender y apagar la
fluorescencia se aumenta la sensibilidad de la detección, porque ello permite
diferenciar fácilmente la señal de lo que es ruido", explica Jares. El problema
es que, cuando hay ruido de fondo, no se puede determinar si la señal es
verdadera. Pero si se modula la fluorescencia, al encenderla y apagarla, se
puede discriminar y restar el ruido, quedando sólo la señal.
Los compuestos que se encienden y se apagan prometen innumerables
aplicaciones, desde la investigación básica hasta los métodos de diagnóstico,
incluso podrían emplearse para la detección de metales en el agua.
¿Qué es la fluorescencia o luminiscencia?
Se trata de una emisión de luz que no es causada por la combustión. Un
ejemplo es la luz que emiten algunos carteles, como las señales de tránsito en
las rutas, o ciertos adhesivos, que brillan en la oscuridad cuando son expuestos
a la luz natural o artificial.
Cuando determinados materiales absorben energía de distintas clases, parte de
esta energía puede ser emitida en forma de luz. Este proceso implica dos pasos.
En el primero, la energía inicial hace que los electrones de los átomos del
material luminiscente se exciten y salten de las órbitas internas de los átomos
a las externas. En un segundo paso, cuando los electrones vuelven a su estado
original, se emite un fotón de luz. El intervalo entre ambos pasos puede ser
corto (menos de una cienmilésima de segundo) o largo (varias horas). Cuando el
intervalo es corto, el proceso se denomina fluorescencia; cuando el intervalo es
largo, fosforescencia. En ambos casos, la luz producida es casi siempre de menor
energía -de mayor longitud de onda- que la luz que produce la excitación.
Existen diferentes tipos de luminiscencia. La que es provocada por una
reacción química se denomina quimioluminiscencia, y ocurre, por ejemplo, cuando
el fósforo amarillo se oxida en el aire produciendo una luz verde. Cuando la
reacción química se produce en un ser vivo, como la luciérnaga, el proceso se
denomina bioluminiscencia. La electroluminiscencia es producida por un gas
recorrido por una descarga eléctrica, como ocurre por ejemplo en los relámpagos
o en una lámpara
fluorescente. La fotoluminiscencia es la luminiscencia que
se produce cuando determinados materiales son irradiados con luz visible o
ultravioleta; por ejemplo, las pinturas fosforescentes.
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